اعلام نرخ ارز

دریافت اپلیکیشن رایگان اعلام نرخ الو ارز مخصوص اندروید. دریافت اپلیکیشن از کافه بازار · دریافت اپلیکیشن از گوگل پلی

اعلام نرخ ارز

دریافت اپلیکیشن رایگان اعلام نرخ الو ارز مخصوص اندروید. دریافت اپلیکیشن از کافه بازار · دریافت اپلیکیشن از گوگل پلی

دانلود پایان نامه فارسی-– (11)- دانلود فایل

دوشنبه, ۱۰ مهر ۱۳۹۶، ۰۸:۲۹ ب.ظ


1-5-2- آلرژی به پروتئین های شیر بین2 تا 7درصد کودکان به شیر گاو آلرژی[30] نشان میدهند که 60 تا70درصد آنها در سال دوم زندگی و 84 تا 87 درصد آنها در سال سوم بهبود مییابند. در آلرژی به شیر گاو سیستم ایمنی دخالت دارد و از اینرو با عارضهی عدم تحمل لاکتوز متفاوت است (Caffarelli …


دانلود پژوهش علمی- – (11)- دانلود ریسرچ

1-5-2- آلرژی به پروتئین های شیر بین2 تا 7درصد کودکان به شیر گاو آلرژی[30] نشان میدهند که 60 تا70درصد آنها در سال دوم زندگی و 84 تا 87 درصد آنها در سال سوم بهبود مییابند. در آلرژی به شیر گاو سیستم ایمنی دخالت دارد و از اینرو با عارضهی عدم تحمل لاکتوز متفاوت است (Caffarelli و همکاران 2010). آنتیژن[31] مولکولی است که اغلب سیستم ایمنی را وادار به پاسخ گویی اختصاصی با استفاده از آنتیبادی میکند. بخشی از مولکول آنتیژن که بوسیله مولکول آنتیبادی شناسایی و به آن متصل میشود اصطلاحا اپیتوپ[32] نام دارد که در مورد پروتئینها میتواند به دو صورت اپی توپ خطی[33] (توالی آمینو اسیدی) و اپیتوپ ساختار فضایی[34] (ساختار سوم پروتئین ) باشد. شکل1-6- نمایی از انواع اپیتوپهای خطی و فضایی پروتئینی. پاسخ سیستم ایمنی به پروتئینهای شیر به عنوان آنتیژن بر اساس میزان حساسیت فرد میتواند از انواع بسیار خفیف تا شوک آنافیلاکسی و مرگ متفاوت باشد. معمولا آلرژی به شیر گاو سه دستگاه گوارش، تنفس و پوست را درگیر میکند (Baehler و همکاران 1996، Salvatore و همکاران 2002، Host و همکاران1994، Heine و همکاران2002). شکل1-7- علائم حساسیت به شیرگاو. به علت طیف وسیع علائم تشخیص، آلرژی به شیر در کودکان یکی از چالشهای پزشکی محسوب میشود. در صورتی که آلرژی کودک به شیر ثابت شود کودک و مادر هر دو از مصرف شیر و فراورده های لبنی منع میشوند که این خود میتواند باعث کمبود انواع ویتامین و مواد معدنی در زمان رشد کودک شود و او را به انواع بیماریها از جمله راشیتیسم مستعد میکند. یکی از روشهایی که به وسیله آن میتوان میزان حساسیت[35] به شیر را در نوزادان کاهش داد، آبکافت[36] ناقص پروتئینهای شیر میباشد. امروزه انواع مختلفی از این نوع شیرها در بازار برای مصرف وجود دارد. البته این روش نیز به طور کامل موثر نیست و بهترین راه برای جلوگیری از خطرات ناشی از مصرف شیر در کودکان عدم مصرف شیر توسط مادر و کودک محسوب می شود (Jarvinen و همکاران 1999، Terheggen-Lagro و همکاران 2002، Sampson و همکاران1991). 1-5-2-1- معرفی انواع آزمونهای رایج جهت مطالعهی فرآیند آلرژی برای تشخیص آلرژی یا آزمونهای پوستی و یا از خون فرد بیمار استفاده میشود (Garcia-Ara و همکاران 2001، Canani و همکاران 2007). در آزمون پوستی قسمتی از پوست بیمار پس از خراش پوستی با یک وسیلهی نوک تیز مقداری از آنتیژن با آن ناحیه تماس داده می شود و از روی قطر ناحیه التهاب و اندازه تاول میزان حساسیت فرد سنجیده میشود (Yuen و همکاران 2007). شکل1-8- آزمون خراش پوستی برای تعیین میزان حساسیت فرد به مادهی آلرژی زا. در آزمونهای خونی که بسیار اختصاصی تر از آزمون پوستی است نمونه سرم خون بیمار که دارای آنتیبادی علیه آلرژن خاص میباشد استفاده میشود. معمولا از روش الایزا[37] برای انجام آزمونهای خون استفاده میشود که میتواند به صورت رنگسنجی یا اندازهگیری نشر فلورسانس[38] و لومینسانس[39] انجام شود. 1-5-2-2- آزمون الایزا از این روش میتوان برای تشخیص یک آنتیبادی اختصاصی که بر علیه یک آلرژن خاص ترشح شده استفاده کرد. آزمون الایزا به روشهای مستقیم[40]، غیرمستقیم[41]، ساندویچی[42] و رقابتی[43] انجام میگیرد که در زیر روش غیرمستقیم که در این پژوهش استفاده شد، شرح داده شده است. در روش الایزای غیرمستقیم، مادهی آلرژن به چاهکهای پلیت 96 خانه ایی الایزا اضافه میشود. سپس پلیت در یک مدت زمان خاص (معمولا به صورت یک شبانه روز در 4 درجهی سانتیگراد) انکوبه میشود. پس از پایان مدت زمان انکوبه پلیت را با بافر شستشو (بافر فسفات سالین حاوی تووین)، 3 مرتبه شستشو میدهند تا آلرژنهایی که به آنتیبادی متصل نشده از چاهک خارج شود. در مرحلهی بعد سرم بیمار به چاهکها افزوده میشود و پلیت مجددا به صورت یک شبانه روز در دمای 4 درجهی سانتیگراد انکوبه میگردد. پس از پایان مدت زمان انکوبه و شستشوی پلیت، آنتیبادی ثانویه که به یک آنزیم (معمولا پراکسیداز یا آلکالین فسفاتاز) متصل است به چاهکها اضافه شده و پلیت به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجهی سانتیگراد در بن ماری انکوبه میگردد. در مرحلهی بعد، سوبسترای آنزیم به چاهکها اضافه و پلیت به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجهی سانتیگراد انکوبه میشود. در نهایت محلول متوقف کنندهی واکنش به چاهکها اضافه شده و میزان جذب یا نشر در یک طولموج خاص خوانده میشود. 1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها اولین بار در سال 1912 به وسیلهی میلارد شرح داده شد. در این واکنش گروه کربونیل قند احیا کننده با گروههای آمین آزاد آمینواسیدهای پروتئین از جمله اپسیلون آمینواسید لیزین، آمینواسیدهای آرژنین و هیستیدن و آمین آلفای انتهای N پروتئین واکنش میدهد. واکنش میلارد طی 3 مرحله انجام میشود: مرحلهی اول: حملهی نوکلئوفیلی گروه آمین آزاد پروتئین به گروه کربونیل قند و تولید حدواسطهای ناپایداری به نام بازشیف است که طی یک مرحله نوآرایی ساختاری، گلوسیتول و کتوآمین (محصول آمادوری) را تولید میکنند. مرحلهی دوم: شامل تبدیل محصولات آمادوری از طریق واکنشهای اکسایش-کاهش به ترکیبات کربونیلی بسیار واکنش پذیر میباشد. مرحلهی سوم: واکنش ترکیبات کربونیلی با زنجیرههای جانبی نوکلئوفیلی آمینواسیدهای همان پروتئین یا پروتئینهای مجاور و ایجاد ترکیبات بسیار سمی پایدار به نام محصولات پیشرفتهی واکنش میلارد[44] (AGE) است (Lapolla و همکاران 2005، Miura و همکاران 2003). حضور ترکیبات احیاکننده در محیط میتواند سرعت تولید ترکیبات حدواسط بازشیف را افزایش داده و به طور انتخابی مسیر واکنش را به سمت تولید گلوسیتول پیش ببرد و محصولات کتوآمین (آمادوری) کمتری نسبت به شرایط غیراحیایی تولید شود (Watkins و همکاران 1985). مطالعات پیشین نشان میدهد قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها با تغییرات ساختاری و عملکردی پروتئین همراه است. از آنجایی که بسیاری از این تغییرات با بیماریهای مختلف از جمله آلزایمر، پارکینسون، سرطان و بیماریهای قلبی-عروقی در ارتباط هستند و همچنین تغییرات ساختاری پروتئینهای مواد غذایی باعث تغییر رنگ، طعم، بو و مزهی این مواد میشود، بررسی فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی از اهمیت زیادی برخوردار است. مطالعات فراوانی روی فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای مختلف از جمله پروتئینهای شیر انجام شده است. شیر به عنوان یک مادهی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات و ترکیبات احیا کنندهایی مانند ویتامینهای E و C محیط مناسبی را برای قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها در شرایط احیایی فراهم میکند. مطالعات پیشین نشان میدهد فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین های شیر بر روی خواص مختلف این پروتئینها از جمله خواص فیزیکی، شیمیایی، بیوشیمیایی و عملکردهای زیستی آنها تاثر قابل توجهی دارد. به عنوان مثال Lee در سال 1979 نشان داد قندی شدن غیرآنزیمی کازئینهای شیرگاو با کاهش ارزش تغذیهایی و قابلیت هضم این پروتئینها همراه است. همچنین Sun در سال 2005 نشان داد قندی شدن غیرآنزیمی آلفا-لاکتالبومین شیرگاو باعث افزایش توان مهار رادیکالهای آزاد و خاصیت آنتیاکسیدانی این پروتئین میشود. فصل دوم 168211517653000 مروری بر پژوهشهای پیشین تحقیقات گستردهایی روی پروتئینهای شیر قندی شده به روش غیرآنزیمی، در گونههای مختلف حیوانات از جمله گاو انجام شده است. این تحقیقات به منظور بررسی تغییرات ساختاری، عملکردی و فعالیتهای زیستی و همچنین استفاده از این پروتئینهای قندی در صنایع غذایی برای بهبود خاصیت امولسیونی، ژلهایی شدن، عطر، طعم، ظاهر و بافت مواد غذایی صورت گرفته است (Honda و همکاران 1999، Nakamura و همکاران1992). در سال 2003 Maleki و همکاران و همچنین در سال 2005 Grube و همکاران بر روی خواص آنتیاکسیدانی پروتئینهای بادامزمینی که به روش غیرآنزیمی قندی شده بود مطالعاتی انجام دادند. نتیجهی این مطالعات نشان داد که قندی شدن غیرآنزیمی باعث افزایش خاصیت آنتیاکسیدانی این پروتئینها میشود. همچنین Chung و همکاران در سال 2001 نشان دادند که مقادیر محصولات نهایی واکنش میلارد (AGE) در بادام زمینی حرارت دیده دو برابر بادام زمینی خام است. نتایج بسیاری از مطالعات پیشین نشان میدهد که قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای شیر، باعث بهبود خاصیت آنتیاکسیدانی (Hayase و همکاران 1990، Rufian- Henares2007، Sun 2004)، آنتی باکتریایی (Rufian-Henares و Morales 2006، 2008) افزایش توانایی ضد فشارخون (Rufian-Henares و Morales 2007) ضد سرطانی (Tsai و Yen 1993) آنها میشود. تاثیر فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی بر روی سرمآلبومین گاوی به وسیلهی Ledesma-Osuna در سال 2008 و با استفاده از قندهای گلوکز، گالاکتوز و لاکتوز مطالعه شد. در سال 2006Sun تغییرات شیمیایی و فعالیت آنتیاکسیدان آلفالاکتالبومین قندی شده به وسیلهی قندهای آلوز، گلوکز و فروکتوز را بررسی کرد، نتایج این تحقیق افزایش خاصیت آتنیاکسیدانی آلفالاکتالبومین را بعد از قندی شدن نشان میداد. همچنین در سال 2005 تاثیر قندی شدن بر روی حلالیت و پایداری گرمایی بتالاکتوگلوبولین به وسیلهی Jimenez-Castano مطالعه شد. در سال 2009 GUتاثیر زمان گرمادهی، دما و pH را بر روی خواص امولسیونی و آنتی اکسیدانی کازئینهای قندی شده با گلوکز به روش غیرآنزیمی مورد مطالعه قرار داد و اثر قندی شدن غیرآنزیمی برروی پایداری، خاصیت امولسیونی، پایداری گرمایی بتالاکتوگلوبولین که با قندهای آرابینوز، گالاکتوز، گلوکز، لاکتوز، رامنوز و ریبوز به روش غیرآنزیمی قندی شده بود، به وسیلهی Chevalier در سال 2001مطالعه شد. Jing تغییرات شیمیایی و بیوشیمیایی کازئینهای قندی شده به روش غیرآنزیمی را در سال 2002 مطالعه کرد. وی همچنین در سال 2004 اثر واکنش میلارد بر روی خواص شیمیایی و سمیت کازئینهای قنده شده بر روی 2 رده سلولی Caco-2 و Int-407 را بررسی نمود. همچنین Lee در سال 1979 تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی احیایی را بر روی ارزش غذایی و قابلیت هضم کازئینها به وسیلهی آنزیمهای پانکراس مطالعه کرد. نتایج این بررسی نشان داد قندی شدن با کاهش ارزش غذایی و قابلیت هضم این پروتئینها همراه است. در سال 2011 Mahran تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی را بر روی کازئینهای شیر بوفالو بررسی کرد. Aminlari و همکاران در سال 2005 نشان داد که قندی شدن غیرآنزیمی کازئینها باعث افزایش پایداری این پروتئینها در pH و دماهای مختلف میشود. همچنین قندی شدن این پروتئینها با افزایش پایداری حرارتی و بهبود خاصیت امولسیونی آنها همراه است. Darewicz در سال 1998 اثر قندی شدن غیرآنزیمی احیایی را بر روی خواص فیزیکوشیمیایی کازئینبتا شیر گاو از جمله نقطه ایزوالکتریک، وزن مولکولی، تحرک الکتروفورتیک و تغییرات ساختاری، بررسی کرد که نتایج این مطالعه نشان داد، قندی غیرآنزیمی کازئینبتا با افزایش نقطهی ایزوالکتریک و وزن مولکولی، بهبود تحرک الکتروفورتیک و افزایش پایداری حرارتی و تغییر حساسیت در هضم به وسیلهی آنزیم تریپسین همراه است. اهداف این پژوهش شیر به علت داشتن درصد بالایی از قندها و ترکیبات احیا کننده مانند ویتامینهای E و C محیط مناسبی را برای قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها در شرایط احیایی فراهم میکند. عملکرد صحیح پروتئینها از جمله پروتئینهای شیر به حفظ ساختار طبیعی آنها بستگی دارد. مطالعات پیشین نشان میدهد که قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها با تغییر ساختار، عملکرد، خواص فیزیکی، شیمیایی و بیوشیمیایی آنها همراه است. همچنین این پژوهشها نشان میدهد بسیاری از بیماریها مانند آب مروارید، پارکینسون، آلزایمر و گرفتگی عروق خونی ارتباط مستقیمی با فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها دارند. لذا بررسی این فرآیند از نظر پزشکی و تغذیهایی دارای اهمیت بسیار زیادی میباشد. از اینرو مطالعهی تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی در شرایط احیایی (شرایطی مانند محیط داخل شیر) بر روی ساختارهای دوم و سوم پروتئین و فعالیتهای زیستی از جمله فعالیت آنتیاکسیدانی، چاپرونی و مهار آنزیم ACE همچنین بررسی تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی بر میزان آلرژیزایی پروتئینهای شیرگاو و کازئینبتا از اهداف اصلی این پژوهش میباشد. فصل سوم 15678159398000 مواد و روشهای تحقیق 3-1- مواد مصرفی پودراستون شش خرگوش حاوی آنزیم (ACE)، آنزیم کیموتریپسین (EC.3.4.21.1)، آنزیم تریپسین (EC.3.4.21.4)، بافر سدیم استات، 2و2-آزینوبیس (3- اتیل بنزوتیازولین-6- سولفونیک اسید) (ABTS)، اوره، EDTA، بتامرکاپتواتانول، سدیمآزید، آنتیبیوتیک پنیسیلین/استرپتومایسین، DEAE- سلولز، کیسه دیالیز، سرم بیماران آلرژیک به شیرگاو، قند گلوکز، قند لاکتوز، اُ- فتالدهید (OPA)، پلیت الایزای 96 خانهایی،Tween-20 ، غشای UF[45]، فلورسامین، پتاسیم پرسولفات، ترییس، گلیسرول، 1- آنیلینو-8- نفتالین سولفونات (ANS)، N-فورناکریلولیل-1- فنیلآلانیلگلایسیلگلایسین (FAPGG)، انسولین، هموگلوبین، ایمیدازول، سدیم کلرید، سدیم سیانوبوروهیدرات (NABH3CN). 3-2- تهیهی محلولها 3-2-1- تهیهی محلولهای کازئینی، بتا کازئین و تعیین غلظت آنها برای تهیهی محلول کازئینی و بتاکازئین مقدار معینی از پودر این پروتئین در بافر فسفات 100 میلیمولار با 4/7 PH حل میشود. پس از انحلال کامل پروتئین در بافر، محلول کازئینی با استفاده از روش برادفورد وثبت جذب در طولموج 595 نانومتر، همچنین محلول بتاکازئین به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر وثبت جذب در طوج موج 280 نانومتر و با استفاده از معادلهی بیرلامبرت[46] (3-1) تعیین غلظت میشود. معادله 3-1 A= ε.C.L در این معادله A میزان جذب، ε ضریبجذب مولی نمونه، C غلظت نمونه و L طول مسیرطی شده بوسیلهی نور است که معمولا 1 سانتیمتر در نظر گرفته میشود. هر پروتئین ضریبجذب مولی مخصوص به خود را دارد. 3-2-2- تهیهی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با استفاده از کازئین بتا برای تهیهی محلول برادفورد 10 میلیگرم از پودر کوماسی بلو G-250 در 5 میلیلیتر اتانول 95 درصد حل میشود و پس از انحلال کامل پودر در اتانول 10 میلیلیتر اسید فسفریک 80 درصد به آن اضافه میشود و مجددا آن را روی دستگاه همزن قرار میدهیم. در ادامه حجم محلول را با آب مقطر به 100 میلیلیتر میرسانیم و در پایان با استفاده از کاغذ صافی واتمن محلول فوق را دو بار فیلتر کرده و در یک ظرف تیره در یخچال (دمای 4 درجه سانتیگراد) تا زمان استفاده نگهداری میکنیم. برای رسم منحنی استاندار برادفورد با استفاده از کازئینبتا از جدول زیر استفاده میشود. جدول3-1- رسم منحنی استاندار برادفورد با استفاده از کازئینبتا (1 میلیگرم بر میلیلیتر) به عنوان پروتئین استاندارد. جذب برادفورد نمونه در طولموج 595 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده میشود. قبل از خواندن جذب نمونه باید دستگاه با نمونه شمارهی 1 که حاوی 1 میلی لیتر برادفور و 100 میکرولیتر آب مقطر است صفر شود. سپس جذب نمونهها در طولموج 595 نانومتر ثبت میشود و با کمک نرمافزار Excel معادله خط و مقدارR2 به دست میآید. از این معادلهی خط به منظور تعیین غلظت نمونههای پروتئینی مجهول استفاده میشود. شکل 3-1- نمونه ایی از نمودار استاندار برادفورد. 3-2-3-تهیهی محلولهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی 3-2-3-1-تهیه محلول SDS20 درصد 2 گرم پودر SDS (شرکت Sigma) در 10 میلیلیتر آب مقطر حل میشود. این محلول در دمای اتاق نگهداری میشود. 3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS) 1/0 گرم پودر سفیدرنگ آمونیوم پرسولفات در 1 میلیلیتر آب مقطر حل میشود. این محلول باید به صورت تازه استفاده شود. آمونیم پر سولفات رادیکال آزاد برای پلیمر شدن آکریلامید و بیس آکریلامید تولید میکند. 3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید 15 گرم پودر آکریلامید و 4/0 گرم پودر بیس آکریلامید در 30 میلیلیتر آب مقطر حل می شود. پس از انحلال کامل پودر این ترکیب، حجم نهایی محلول آن به 50 میلیلیتر رسانده می شود. این محلول باید در یخچال نگهداری شود. 3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار برای تهیه این بافر 829/90 گرم پودر تریس (Da121) در 400 میلیلیتر آب مقطر حل می شود، سپس pH محلول با استفاده از HCL (N2) به 8/8 رسانده میشود. پس از تنظیم pH محلول، حجم نهایی آن با استفاده از آب مقطر به 500 میلیلیتر رسانده میشود و از کاغذ صافی برای فیلتر کردن آن استفاده میشود. این محلول برای قسمت جداکننده (Resolving) ژل استفاده میشود. این محلول در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری میشود. 3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار به منظور تهیه این بافر 55/60 گرم از پودر تریس (Da121) در 400 میلیلیتر آب مقطر حل میشود. سپس pH محلول با استفاده از HCL (N2) به 8/6 رسانده میشود. در آخر حجم نهایی محلول با استفاده از آب مقطر در 500 میلیلیتر تنظیم میشود. این محلول پس از فیلتر با کاغذ صافی در یخچال و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری میشود. از این بافر برای قسمت Stacking ژل استفاده میشود. 3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلی لیتر برای تهیه 500 میلیلیتر بافر تانک، 51/1 گرم تریس، 5/7 گرم گلایسین و 5/0 گرم SDS (1/0درصد) در 500 میلیلیتر آب مقطر حل میشود. سپس محلول را با استفاده از کاغذ صافی فیلتر کرده و در دمای اتاق نگهداری میشود. جدول 3-2- مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه 500 میلی لیتر بافر تانک. 3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X2 این بافر حاوی SDS، بتامرکاپتواتانول، تریس، گلیسرول و بروموفنلبلو میباشد. مقادیر لازم برای ساخت 25 میلیلیتر از این بافر در جدول 3-3 آورده شده است. جدول3-3- مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه 25 میلیلیتر بافر نمونه X2. از بافر نمونه برای رنگآمیزی و مشاهدهی حرکت نمونه در ژل استفاده میشود. بافر X2 به نسبت یک به یک با نمونهی مورد نظر مخلوط و به مدت 5 تا 10 دقیقه در آب جوش جوشانده میشود. سپس نمونه به مقدار مورد نیاز در چاهک ژل منتقل میگردد. این بافر در دمای 4 درجه سانتیگراد و برای نگهداری طولانی مدت در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری میشود. 3-2-3-8- تهیه 100 میلی لیتر محلول کوماسی بلو به منظور تهیه محلول رنگآمیزی[47] ژل، 1/0 گرم پودر کوماسیبلو R-250 در 30 میلیلیتر اتانول حل میشود. پس از اینکه پودر به وسیلهی دستگاه همزن کاملا در اتانول حل شد، 10 میلیلیتر اسیداستیک به آن اضافه میشود و مجددا محلول روی دستگاه هم زن قرار داده می شود تا خوب حل شود. در آخر با استفاده از آب مقطر حجم نهایی محلول به 100 میلیلیتر رسانده میشود. در ادامه این محلول با استفاده از کاغذ صافی فیلتر میشود. رنگ کوماسی بلو به صورت غیرکولان به گروههای آمین پروتئین متصل میشود و به این ترتیب محل قرارگیری پروتئین در ژل را مشخص میکند. محلول رنگآمیزی را میتوان در دمای اتاق نگهداری کرد. 3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل به منظور حذف رنگ کوماسیبلو اضافی از زمینه ژل از محلول رنگبر[48] استفاده میشود. این محلول حاوی 30 میلیلیتر اتانول، 10 میلیلیتر اسیداستیک و 60 میلیلیتر آب مقطر میباشد. 3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلیلیتر به منظور تهیه محلول OPA ابتدا پودر سدیم بورات را در آب مقطر ریخته و به کمک دستگاه همزن کاملا در آب مقطر حل میکنیم. سپس به 25 میلیلیتر از این محلول 5/2 میلیلیتر محلول SDS (20 درصد)، 100 میکرولیتر بتامرکاپتواتانول و 1 میلی لیتر محلول OPA که شامل 40 میلیگرم OPA حل شده در 1 میلیلیتر متانول است اضافه میشود. آنگاه حجم نهایی محلول به 50 میلیلیتر رسانده میشود. این محلول باید به صورت تازه استفاده شود (Fayle و همکاران 2001). از محلول OPA میتوان برای تعیین کمی قندی شدن پروتئین استفاده کرد. جذب این محلول در طولموج340 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده میشود. در شکل زیر نمایی از ساختار شیمیاییOPA را مشاهده میشود. شکل 3-2- نمایی از ساختارشیمیایی ترکیبOPA. 3-2-5- تهیه محلول فلورسامین برای تهیه محلول فلورسامین مقدار مشخصی از پودر آن در حلال استونیتریل حل میشود تا غلظت نهایی آن 1 میلیمولار شود. از محلول فلورسامین نیز میتوان برای تعیین میزان قندی شدن پروتئین استفاده کرد. طیف نشری فلورسامین با استفاده از دستگاه فلورسانس و در طولموجهای 400 تا 600 نانومتر خوانده میشود. این ترکیب در طولموج 390 نانومتر برانگیخته میشود. در شکل زیر نمایی از ساختار ترکیب فلورسامین را مشاهده میکنید. شکل 3-3- نمایی ازساختار شیمیایی ترکیب فلورسامین. 3-2-6- تهیه محلول ANS ANS یک نشانگر فلورسانسی است که به سطوح آبگریز پروتئین متصل میشود. این ترکیب زمانی که در طول موج 365 نانومتر برانگیخته شود، دربازه طولموج 400 تا 600 نانومتر نشر فلورسانس دارد (Barzegar و همکاران 2008). برای تهیه محلول ANS، 10 میکرولیتر از استوک اصلی ANS در 990 میکرولیتر آب مقطر حل میشود و سپس این محلول فیلتر میگردد. ضریبجذب مولی ANS در آب مقطر M-1 cm-1 495 است. جذب در طولموج 325 نانومتر به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده می شود. آنگاه غلظت این ترکیب با استفاده از قانون بیرلامبرت تعیین میشود. در شکل (3-4) نمایی از ساختار ترکیب ANS آورده شده است. شکل 3-4- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب ANS. 3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال برای تهیه محلول رادیکالABTS مقدار معینی از پودر سبز رنگ این ترکیب در 1 میلیلیتر آب مقطر حل میشود به طوری که غلظت نهایی آن 7 میلیمولار شود. سپس مقدار معینی از پودر پتاسیم پر سولفات را وزن کرده به محلول ABTS اضافه میکنیم. غلظت نهایی پتاسیم پرسولفات در این محلول باید 45/2 میلیمولار باشد. این محلول را به مدت 12 تا 16 ساعت در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری میشود تا پتاسیم پرسولفات ترکیبABTS را اکسید کرده و رادیکالهای آزاد ABTS ساخته شود (Re و همکاران 1998). محلول رادیکال ABTS را میتوان به مدت 2 روز در دمای اتاق و در شرایط تاریکی نگهداری و استفاده کرد. رادیکال ABTS در طولموجهای 645، 734 و 815 نانومتر دارای بیشینهی جذب است که در این مطالعه از طولموج 734 نانومتر برای بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی پپتیدهای حاصل از هضم کازئینهای قندی و غیرقندی استفاده شده است (Re و همکاران 1998، Salami و همکاران 2011). شکل 3-5- تولید ABTS رادیکال در حضور پتاسیم پرسولفات. 3-2-8- تهیه عصارهی ACE از پودر استون شش خرگوش  
 نکته مهم : هنگام انتقال متون از فایل ورد به داخل سایت بعضی از فرمول ها و اشکال (تصاویر) درج نمی شود یا به هم ریخته می شود یا به صورت کد نشان داده می شود ولی در سایت اصلی می توانید فایل اصلی را با فرمت ورد به صورت کاملا خوانا خریداری کنید: سایت مرجع پایان نامه ها (خرید و دانلود با امکان دانلود رایگان نمونه ها) : jahandoc.com   برای تهیه عصارهی ACE، 1/0 گرم از پودر استون شش خرگوش در 1 میلیلیتر بافر تریس 50 میلیمولار با 2/8pH، حاوی 5 درصد گلیسرول مخلوط و سپس با هاون دستی به خوبی هموژن میشود. مخلوط به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری میشود. پس از گذشت زمان 24 ساعت، مخلوط به مدت 20 دقیقه با دور rpm2000 (در دمای 4 درجه سانتیگراد) سانتریفیوژ میشود. پس از سانتریفیوژ، مایع قهوهایی رنگ شفاف فوقانی که حاوی مقدار زیادی آنزیم ACE است جدا کرده و تا زمان استفاده در دمای 4 درجهی سانتیگراد نگهداری میگردد (Vermeirssen و همکاران 2002). 3-3- روش ها 3-3-1- تخلیص بتا کازئین شیر گاو برای جداسازی پروتئینهای کازئینی از پروتئینهای آبپنیر، ابتدا شیر تازهی گاو با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ و با دور rpm7720 به مدت 15 دقیقه (در دمای 4 درجه سانتیگراد) چربیزدایی شد. سپس pH شیر با استفاده ازHCL (N2) به 6/4 کاهش یافت تا کازئینها در این pH که pH ایزوالکتریک این پروتئینها است، رسوب کرده واز پروتئینهای آبپنیر (Whey) جدا شود. رسوب کازئینی 3 بار با استفاده از آب مقطر با دور rpm8400 به مدت 60 دقیقه در دمای 4 درجهی سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا پروتئینهای آب پنیر به طور کامل جدا شود. در مرحلهی بعد رسوب حاصل با استفاده از دستگاه خشک کن انجمادی[49] پودر شد و پودر حاصل تا زمان استفاده در 20- درجه سانتیگراد نگهداری میشود. برای تخلیص کازئینبتا ابتدا 1 گرم پودر کازئین در 60 میلیلیتر بافر سدیماستات 20 میلیمولار با 6/6 pH حاوی 4 مولار اوره، 35 میلیمولار EDTA و 10 میلیمولار بتامرکاپتواتانول حل و سپس با دورrpm4500 به مدت 20 دقیقه و در 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول پروتئینی با ماتریکس DEAE- سلولز مخلوط و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت روی شیکر در دمای 4 درجه سانتیگراد هم زده شد (ماتریکس DEAE- سلولز از قبل با بافر سدیم استات 20 میلیمولار به تعادل رسیده بود). در مرحلهی بعد مخلوط ماتریکس پروتئین به ستون انتقال داده شد و بعد از 15 دقیقه خروجی ستون در لولههای فالکون 50 میلیلیتری جمعآوری شد. برای تعیین میزان خلوص پروتئین از SDS-PAGE احیایی (12 درصد) استفاده شد. حجمهایی که بیشترین میزان خلوص را نشان دادند با هم مخلوط و بر علیه بافر ایمیدازول 20 میلیمولار با 3/7 pH حاوی 4 مولار اوره و 10 میلیمولار بتامرکاپتواتانول دیالیز شد.آنگاه این مخلوط پروتئینی به ستون DEAE- سلولز که از قبل با بافر ایمیدازول 20 میلیمولار به تعادل رسیده بود منتقل شد. در این مرحله از شیب نمک سدیم کلرید با دامنه غلظتی0تا 25/0 میلیمولار برای تخلیص پروتئین استفاده شد و خروجی ستون با سرعت 1 میلیلیتر در دقیقه و در حجمهای 4 میلی لیتر جمعآوری شد. آنگاه از روشSDS-PAGE درصد خلوص پروتئین مشخص گردید. سپس حجمهایی با بیشترین درصد خلوص پروتئین با هم مخلوط و برعلیه آب مقطر دیالیز شد. سپس پروتئین کازئینبتای خالص به کمک دستگاه خشککن انجمادی پودر شد (Barzegar و همکاران2008). پودر کازئینبتا در دمای20- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شد. 3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان به منظور خالصسازی هموگلوبین، به 9 میلیلیتر خون تازه، 1 میلیلیتر سدیم سیترات 4درصد اضافه میشود تا مانع از انعقاد آن گردد. سپس خون به مدت 15 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتیگراد با دورrpm3000 سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته میشود. در مرحلهی بعد به آن 10 حجم محلول کلریدسدیم 9/0درصد اضافه میشود. آنگاه به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد با دورrpm10000 سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته میشود. به رسوب حاصل 5 حجم بافرفسفات 2/0 مولار با 4/7pH اضافه میشود و دوباره به مدت 15 دقیقه با دورrpm5000 در 4 درجهی سانتیگراد سانتریفیوژ و مایع رویی خارج میشود. در ادامه به منظور هضم گلبولهای قرمز 9 برابر حجم رسوب، آب مقطر سرد اضافه و به مدت 10 دقیقه با دور rpm18000 سانتریفیوژ میشود. مایع رویی حاوی هموگلوبین میباشد، آن را جدا کرده و نمک آمونیوم سولفات 20 درصد به آن اضافه میشود و پس از گذشت زمان 15 دقیقه در دمای 2 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت با دورrpm 14000 سانتریفیوژ میشود. برای جدا سازی ترکیب 2 و 3 دیفسفوگلیسرات از هموگلوبین، محلول در بافرفسفات 50 میلیمولار با 4/7pH به مدت 12 تا 24 ساعت دیالیز میشود. محلول هموگلوبین حاصل در دمای 70- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری میشود (Benesch و همکاران 1969، Riggs و همکاران 1981، Rossi و همکاران 1961، Romeo و همکاران 2003). 3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE یکی از روشهای ساده، ارزان و معمول که برای تعیین میزان خلوص و وزنمولکولی پروتئینها استفاده میشود استفاده از الکتروفورز ژلی است (Phizicky و همکاران 1995). در SDS-PAGE به دلیل استفاده از سدیمدودسیلسولفات تمام پروتئینها بار منفی میگیرند. درنتیجه آنچه باعث افتراق و جدایی آنها از یکدیگر میشود اندازه و وزنمولکولی پروتئین میباشد که معمولا پروتئینهای کوچکتر و با وزنمولکولی کمتر با سرعت بیشتری طول ژل را طی می کنند. در این پژوهش برای تعیین میزان خلوص پروتئینهای کازئینبتا و هموگلوبین از ژل (12 درصد احیایی) استفاده شد. 3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش پودر استون شش خرگوش منبع مناسبی برای تهیه آنزیم ACE است (Lossow و همکاران2011). در این پژوهش ابتدا به کمک غلظت بالایی از ترکیب شیمیایی اتر خرگوشها بیهوش شدند. سپس بافت شش آنها خارج و با کلریدسدیم 9/0درصد شستشو داده شد. در مرحلهی بعد ششها با یک برابر حجم بافرفسفات 01/0 مولار با 4/7pH هموژن شدند و به مخلوط هموژن 10 برابر حجم آن استون نگهداری شده در دمای 20- سانتیگراد اضافه شد. این مخلوط ده دقیقه در فضای اتاق قرار گرفت. سپس این نمونه به مدت 30 دقیقه با دورrpm5000 (در دمای 4 درجه سانتیگراد) سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل با 15 برابر حجم استون سرد مجددا به مدت 30 دقیقه و با دورrpm5000 سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته شد و رسوب آن جمعآوری و روی کاغذ صافی واتمن پخش گردید و روی آن با ورقه آلومینیوم پوشانیده شد. پودر استون شش خرگوش در دمای 4 درجه سانتیگراد خشک شد. پودر حاصل تا زمان استفاده دردمای20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید (Lossow و همکاران 2011). 3-3-5- قندی کردن کازئینبتا و کازئینهای شیرگاو به روش غیرآنزیمی برای قندی کردن پروتئینهای کازئینی از بافر فسفات 100 میلیمولار با 4/7 pH، حاوی سدیم سیانوبوروهیدرات 212 میلیمولار و دو قند گلوکز و لاکتوز با غلظت 270 میلیمولار استفاده شد. مخلوط کازئین سدیم سیانوبوروهیدرات و قند به مدت 120 ساعت در دمای 37 درجهی سانتیگراد و در شرایط تاریکی انکوبه شد. برای جلوگیری از رشد باکتری در محلول انکوبه از سدیمآزید با غلظت 1/0 میلیگرم در میلیلیتر استفاده شد. سدیم سیانوبوروهیدرات ترکیبی با خاصیت احیاکنندگی انتخابی است که باعث افزایش سرعت تولید و تبدیل حدواسطهایی موسوم به بازشیف به ترکیبات آمادوری میشود. بعد از گذشت زمان 120 ساعت پروتئینهای قندی شده به مدت 24 ساعت برعلیه آب مقطر دیالیز و به منظور تایید فرآیند قندی شدن از SDS-PAGE احیایی (12 درصد) استفاده شد. (Lee و همکاران1979، Darewicz و همکاران 1998). 3-3-6- آزمونهایOPA و فلورسامین برای تایید فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی به منظور تایید قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای کازئینی از آزمون جذبی OPA و آزمون نشری فلورسامین استفاده شد. ترکیب OPA بعد از اتصال به گروههای آزاد آمین پروتئین در طول موج340 نانومتر دارای افزایش جذب میباشد. وقتی پروتئین قندی میشود به دلیل اتصال قند به گروههای آمین آزاد این ترکیب قادر به واکنش با این گروهها نیست و در نتیجه میزان جذب 340 نانومتر پروتئین های قندی نسبت به انواع غیرقندی کاهش مییابد. غلظت پروتئین مورد استفاده 5/0 میلی گرم و مدت زمان انکوبه 2 دقیقه در دمای اتاق بود (Church و همکاران 1983). روش دوم برای تایید فرآیند قندی شدن استفاده از نشر فلورسانس فلورسامین است. نشر فلورسانس این ماده نیز با اتصال به گروههای آمین آزاد پروتئین افزایش مییابد. در نتیجه اگر گروههای آمین با قند واکنش داده باشند کاهش نشر در محدوده طولموجهای 400 تا 600 نانومتر دیده میشود (Sattarahmady و همکاران 2007). در این روش 25 میکرولیتر از پروتئین با غلظت 1 میلیگرم در میلیلیتر با 500 میکرولیتر بافرفسفات 50 میلیمولار و 225 میکرولیتر آب مقطر و 250 میکرولیتر محلول فلورسامین به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق و در شرایط تاریکی انکوبه شد. سپس نشر فلورسامین با استفاده از دستگاه فلورسانس در بازه طولموجهای 400 تا 600 خوانده شد. در این مطالعه طولموج برانگیختگی 390 نانومتر و شکافهای برانگیختگی و نشری به ترتیب 5 و 10 نانومتر بود. 3-3-7- مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی به منظور مطالعهی ساختار سوم بتا کازئینهای قندی و غیرقندی و تغییرات ساختاری حاصل از فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی از فلورسانس ذاتی و عارضی (با استفاده از نشانگرANS) استفاده شد. برخی از مولکولها مانند پروتئینها به علت وجود آمینواسیدهای آروماتیک و اسیدهای نوکلئیک به دلیل داشتن حلقههای پورینی و پیریمیدینی به طور ذاتی دارای نشر فلورسانس هستند که از این خاصیت میتوان برای مطالعهی ساختار فضایی و تغییرات ساختارشان بهره برد. معمولا برای ایجاد نشر فلورسانس اتمهای مولکول برانگیخته شده و به سطح بالاتری از انرژی میروند که در این سطح بسیار ناپایدار بوده و ضمن برگشت به سطح اولیه قسمتی از انرژی به صورت نشر فلورسانس و بخش دیگر آن به صورت گرما رها میشود. شدت فلورسانس را بازده کوانتمی مینامند (Q) و آن را از معادلهی زیر محاسبه میکنند. معادله 3-2 تعداد فوتون جذبی/تعداد فوتون نشری=Q نشر فلورسانس در محیطهای قطبی کاهش و در محیطهای غیرقطبی افزایش مییابد (Chamberlain و همکاران 2000). برای مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینبتا از غلظت 10 میکرومولار پروتئین و بافرفسفات 100 میلیمولار با 4/7 pH استفاده شد. طولموج برانگیختگی 295 نانومتر بود و طیف نشری در محدودهی طولموجهای 300 تا 500 نانومتر به وسیلهی دستگاه اسپکتروپولاریمتر (مدل Cary-Eclips، ساخت کشور استرالیا) دارای لامپ زنون و گزارشگر دادهای DR3108 در دمای اتاق ثبت شد. شکاف برانگیختگی و نشری به ترتیب 5 و 10 نانومتر بود. 3-3-8- مطالعهی فلورسانس عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی در این مطالعه از نشانگر فلورسانس ANS که قادر به اتصال به سطوح آبگریز پروتئین است، استفاده شد. در این مطالعه غلظت پروتئین 10 میکرومولار و غلظت ANS 100 میکرومولار انتخاب شد. فرآیند انکوبه به مدت 30 دقیقه در تاریکی و در دمای اتاق انجام شد. طولموج برانگیختگی 365 و نشر در بازه طولموجهای 400 تا 600 نانومتر ثبت گردید. شکاف برانگیختگی و نشری نیز به ترتیب 5 و 10 نانومتر بود (Barzegar و همکاران 2008). 3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئینهای بتای قندی و غیرقندی، با استفاده از دستگاه دورنگنمایی دورانی به منظور بررسی تغییرات ساختار دوم کازئینبتا ضمن قندی شدن غیرآنزیمی از دستگاه دورنگنمایی دورانی مجهز به سیستم دمایی و محدودهی دور فرابنفش(Far-UV CD) بین طولموجهای 190 تا 250 نانومتر استفاده شد. در این مطالعه از بافرفسفات 25 میلیمولار با 5/7 pH و غلظت 4/0 میلیگرم بر میلیلیتر پروتئین استفاده شد. تمام اندازهگیریها در دمای 25 درجهی سانتیگراد انجام گردید. کازئین بتا دارای 209 آمینواسید و وزنمولکولی 24000 دالتون میباشد در نتیجه برای تعیین بیضیت مولاری[50] از معادلهی (3-6) استفاده شد (Kelly و همکاران 2005). معادلهی 3-3 /CL)[θ]λ = (100.(MRW).[θ]obs در این معادله λθ بیضیت مشاهده شده در یک طولموج خاص، C غلظت پروتئین بر حسب میلیگرم بر میلیلیتر، L طول مسیر عبور نور بر حسب سانتیمتر، MRW میانگین وزن باقی ماندههای آمینواسیدی در زنجیرهی پلیپپتیدی که از فرمول M/(N-1) محاسبه میشود (M وزن مولکولی زنجیرهی پلیپپتیدی بر حسب دالتون و N تعداد آمینواسیدها در زنجیرهی پلی پپتیدی است) میباشد. پس از محاسبهی بیضت مشاهده شده برای پروتئین این بیضیت از بیضیت بافر کم شده و نتایج بدست آمده توسط نرم افزار CDNN[51] آنالیز و میزان ساختار دوم پروتئین براساس درصد بیان شد (Bohem و همکاران 1992). 3-3-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی برای مطالعهی فعالیت چاپرونی از انسولین با غلظت 3/0 میلیگرم در میلیلیتر و هموگلوبین با غلظت 5/0 میلیگرم در میلیلیتر به عنوان پروتئین هدف استفاده شد. برای تودهایی کردن انسولین از ترکیب شیمیایی DTT (20 میلیمولار) و برای تودهایی کردن هموگلوبین از استرس دمایی (57 درجهی سانتیگراد) استفاده شد. غلظت کازئینبتا 05/0، 1/0 و 2/0 میلیگرم در میلیلیتر انتخاب شد. مدت زمان انکوبه 5 دقیقه در دمای اتاق بود و جذب در 360 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل +T90 به مدت 15 دقیقه خوانده شد. در این آزمایش از بافرفسفات 50 میلیمولار با 4/7pH استفاده شد. 3-3-11- هضم کازئینهای شیرگاو و کازئینبتای قندی و غیرقندی به وسیلهی آنزیمهای تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی در این مطالعه ازآنزیمهای تریپسین (EC.3.4.21.4) و کیموتریپسین پانکراس گاوی (EC.3.4.21.1) استفاده شد. غلظت پروتئین 2 و 5 میلیگرم در میلیلیتر و بافر مورد استفاده بافر فسفات 20 میلیمولار با 8/7pH بود. مدت زمان هضم 2 و 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و در تاریکی انتخاب شد. در پایان آنزیمها در دمای 85 درجهی سانتیگراد به مدت 15 دقیقه غیر فعال شد. برای تایید فرآیند هضم کازئینها از SDS-PAGE (15 درصد) و آزمونOPA استفاده شد. فرآیند هضم پروتئین با افزایش گروههای آمین آزاد همراه است. در نتیجه با افزایش میزان هضم جذب OPA محلول کازئینی درطولموج 340 نانومتر زیاد میشود، که میتواند تاییدی بر هضم پروتئین باشد (Church وهمکاران 1983، Pralea و همکاران 2011). برای محاسبهی درجه هضم از معادله زیر استفاده شد. معادله3-4 ΔAتغییرات جذب در طولموج 340 نانومتر، M وزن مولکولی پروتئین برحسب دالتون، d فاکتور رقت، ε ضریبجذب مولیOPA وقتی به گروه آمین اسیدهای آمینه متصل میشود و برابر با Mol-1 cm-16000، C غلظت نمونه و N تعداد کل پیوندهای پپتیدی میباشد. 3-3-12- مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی کازئینهای شیرگاو وکازئین بتای قندی و غیرقندی برای انجام این مطالعه از بافرفسفات 5 میلیمولار با 4/7pH ، محلول رادیکال +ABTS و غلظت های 25، 5/37 و 50 میکروگرم در میکرولیتر پروتئین استفاده شد. تغییرات جذب در 734 نانومتر به وسیله دستگاه اسپکتروفوتومتر و در مدت 6 دقیقه ثبت شد. در این مطالعه حجمی از محلول ABTS به کووت اضافه شد که جذب آن در 734 نانومتر برابر 02/0± 7/0 باشد. از محلول ترولوکس به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و فعالیت آنتیاکسیدانی نمونهها برحسبTEAC(μΜ) بیان شد. از معادلهی (3-5) برای تعیین درصد مهار رادیکالهای آزاد استفاده شد (Fan و همکاران 2012). 183007088900001899920876300018300708890000معادله 3-5 100 (AC/ AS-1)% Inhibition= برای بیان فعالیت آنتیاکسیدانی نمونه ها برحسب TEAC(μM)[52] نمودار استاندار ترولوکس با غلظتهای 0 تا 15 میکرومولار رسم و شیب نمودار آن به وسیله نرمافزار Excel تعیین شد. همچنین نمودار غلظت بر درصد مهار نمونهها رسم و شیب آن به وسیله نرمافزار Excel محاسبه گردید. از تقسیم شیب نمودار نمونهها برشیب نمودار ترولوکس فعالیت آنتیاکسیدانی معادل ترولوکس نمونهها بدست آمد (Re و همکاران1998). شکل 3-6- نمونهایی از نمودار استاندارد ترولوکس. 3-3-13- مطالعهی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای بتای قندی و غیر قندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها به منظور مطالعه مهار آنزیم ACE سوبسترای این آنزیم موسوم بهN-(3-(2-فوریل (اکریلویل)-فنیل آلانین-گلایسین-گلیسین[53] (1 میلیمولار) در بافر تریس با غلظت50 میلیمولار و دارای 400 میلیمولار سدیم کلرید با 3/8pH حل شد. غلظت سوبسترا 1 میلیمولار بود. سپس 150 میکرولیتر از سوبسترا در هر چاهک ریخته شد. در ادامه 50 میکرولیتر از نمونهی پروتئین به چاهک اضافه و به مدت 2 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد، و در پایان به هر چاهک 10 میکرولیتر از عصارهی آنزیم ACE که از شش خرگوش استخراج شده بود اضافه گردید. آنگاه تغییرات جذب به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد و در طولموج 340 نانومتر خوانده شد (Vermeirssen وهمکاران 2002). درصد مهار آنزیم ACE از معادلهی (3-6) محاسبه شد (Lahogueو همکاران 2010، Asoodeh و همکاران 2011). معادله 3-6

موافقین ۰ مخالفین ۰ ۹۶/۰۷/۱۰
postel postel

نظرات  (۰)

هیچ نظری هنوز ثبت نشده است

ارسال نظر

ارسال نظر آزاد است، اما اگر قبلا در بیان ثبت نام کرده اید می توانید ابتدا وارد شوید.
شما میتوانید از این تگهای html استفاده کنید:
<b> یا <strong>، <em> یا <i>، <u>، <strike> یا <s>، <sup>، <sub>، <blockquote>، <code>، <pre>، <hr>، <br>، <p>، <a href="" title="">، <span style="">، <div align="">
تجدید کد امنیتی